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pcr擴(kuò)增的原理和具體實(shí)驗(yàn)步驟

 更新時(shí)間:2022-07-27 點(diǎn)擊量:3617

pcr擴(kuò)增的原理和具體實(shí)驗(yàn)步驟

PCR實(shí)驗(yàn)是分子生物學(xué)中常見用的實(shí)驗(yàn)之一,在基因擴(kuò)增、核酸檢測(cè)、基因檢測(cè)等方面廣泛應(yīng)用。pcr擴(kuò)增的原理和步驟如下:

一、試劑準(zhǔn)備:
PCR常用的試劑主要包括 DNA 模板、引物、ddH 2 O、 DNA 聚合酶以及特定的反應(yīng)緩沖液、dNTP、MgSO 4(可選)和 DMSO (可選)。 

二、PCR實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備
在開始PCR實(shí)驗(yàn)之前,必須準(zhǔn)備好DNA模板(基因組DNA 或逆轉(zhuǎn)錄制備的cDNA)、特異性引物(自己設(shè)計(jì)或用軟件設(shè)計(jì)),并選擇合適的商業(yè)酶(選擇符合您實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡拿? 

1.DNA聚合酶。有許多商業(yè) DNA 聚合酶,它們具有不同的特性。一般分為兩類:高保真聚合酶和普通Taq 聚合酶。如果您想對(duì)沒(méi)有任何突變的特定 DNA 片段進(jìn)行 PCR,請(qǐng)選擇高保真聚合酶。如果只是想檢測(cè)特定序列的存在,就選擇普通的 Taq 聚合酶。如果要對(duì)T-vector連接的片段進(jìn)行PCR,要注意 ,因?yàn)榇蠖鄶?shù)高保真聚合酶的產(chǎn)物都沒(méi)有 A-tailing,所以應(yīng)該選擇普通的Taq聚合酶或在PCR 實(shí)驗(yàn)后添加 A-tailing。

2.引物的特異性影響 PCR 成功的概率,良好的引物設(shè)計(jì)對(duì) PCR 擴(kuò)增的成功至關(guān)重要。當(dāng)您開始設(shè)計(jì)引物時(shí),應(yīng)仔細(xì)考慮以下幾個(gè)原則:
①引物的長(zhǎng)度。PCR引物一般在18-22bp左右。這對(duì)于引物特異性和在退火溫度下的結(jié)合來(lái)說(shuō)是足夠長(zhǎng)的。
②熔化溫度(Tm)。Tm 定義為在此溫度下,DNA 雙鏈體的一半將解離成單鏈 DNA。52-58C 范圍內(nèi)的引物 Tm 是*佳的。
③GC 含量。*佳 GC 含量應(yīng)為 40-60%。
④許多軟件可用于引物設(shè)計(jì),例如primer5和Oligo。這些軟件推薦的引物通常可以滿足我們的需求。

pcr實(shí)驗(yàn)步驟

三、 pcr實(shí)驗(yàn)步驟:
根據(jù)PCR使用說(shuō)明進(jìn)行試劑混合預(yù)配,并設(shè)置 PCR 循環(huán)。
簡(jiǎn)而言之,pcr擴(kuò)增的原理和步驟需要經(jīng)過(guò)以下 循環(huán):
1.初始化步驟。這僅對(duì)熱啟動(dòng) PCR。此步驟將溶液加熱至 94-98°C ,以激活 DNA 聚合酶。該步驟的時(shí)間取決于所使用的聚合酶。
2.變性步驟。DNA是雙鏈分子,DNA擴(kuò)增需要引物與單鏈 DNA模板相互作用。在此步驟中,將反應(yīng)混合物加熱至 94-98°C 并保持 20-30 秒,以破壞兩條鏈之間的氫鍵并生成單鏈 DNA 分子。此時(shí)進(jìn)入 PCR 循環(huán)。
3.退火步驟。變性后,反應(yīng)混合物中的 DNA 模板是單鏈的。由于引物與DNA模板互補(bǔ),當(dāng)反應(yīng)溫度降低到 50-65℃時(shí),引物會(huì)與模板序列匹配,互補(bǔ)堿基之間形成氫鍵。退火溫度取決于所用引物的Tm,一般比引物Tm 低 3-5℃左右。該步驟將持續(xù)約 20-40 秒以*退火,然后聚合酶將定位到引物- 模板雜交體以開始 DNA 組裝。
4.伸長(zhǎng)步驟。在此步驟中,DNA 聚合酶開始合成 DNA,因此溫度應(yīng)為 DNA 聚合酶的最適溫度。一般選擇 72°C,但有些酶在 68°C 時(shí)效果更好。這一步與體內(nèi) DNA復(fù)制非常相似,DNA聚合酶將dNTPs添加到引物中,以 5' 到3'方向與模板互補(bǔ),最終產(chǎn)生新的雙鏈DNA片段。延伸時(shí)間取決于目標(biāo) DNA 片段的長(zhǎng)度和 DNA 聚合酶的能力。一般來(lái)說(shuō),DNA 聚合酶每 60 秒產(chǎn)生一千個(gè)堿基。
5. 循環(huán)。2~4步稱為一個(gè)循環(huán),每循環(huán)一次,目標(biāo)片段量翻倍。一個(gè) PCR 過(guò)程使用 30-35 個(gè)循環(huán)。在 PCR 循環(huán)的早期,PCR 產(chǎn)物以指數(shù)速率積累,而在 PCR 循環(huán)的后期,隨著 dNTPs、引物的減少和 DNA 聚合酶在變性溫度下的失活,反應(yīng)減慢,PCR 速率逐漸下降。
6.終伸長(zhǎng)率。30-35個(gè)循環(huán)結(jié)束后,在68-74℃的溫度下終延伸約 5-10分鐘,以充分延伸剩余的單鏈DNA。
7.貯存。產(chǎn)品可以在 PCR 機(jī)器中維持溫度在 4-10°C。

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